K7M2-WT細胞

一、細胞特性

1. 細胞名稱：K7M2-WT細胞（小鼠骨肉瘤成骨細胞）
2. 形態：成骨細胞樣，貼壁生長
3. 含量：>1x10⁶ 個/瓶
4. 污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性
5. 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

二、細胞接收后的處理：
1、貼壁細胞

1. 收到T25方瓶細胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發給我們（凍存管細胞收到后直接37℃水浴復蘇或直接放置于液氮中長期儲存）。
2. 請先在顯微鏡下確認細胞生長狀態，去掉封口膜并將T25瓶置于37℃培養約2-3h。
3. 棄去T25瓶中的培養基，換用新鮮的*培養基。
4. 如果細胞長滿（90%以上）請及時進行細胞傳代。
5. 接到細胞次日，請檢查細胞是否污染，若發現污染或疑似污染，請及時與我們取得聯系。

2、懸浮細胞

1. 收到細胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發給我們。
2. 請先在顯微鏡下確認細胞生長狀態，去掉封口膜并將15ml離心管置于37℃培養約2-3h。
3. 1200rpm離心5min，棄去15ml離心管中的培養基，細胞沉淀用新鮮的*培養基重懸并培養。
4. 如果細胞長滿（90%以上）請及時進行細胞傳代。
5. 接到細胞次日，請檢查細胞是否污染，若發現污染或疑似污染，請及時與我們取得聯系。

                      
本公司的細胞培養操作規程，供參考
一、K7M2-WT細胞培養基及培養凍存條件準備：

1. 準備H-DMEM培養基，90%；優質胎牛血清，10%。
2. 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。
3. 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。液氮儲存。

二、細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

   對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化2-3分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3ml此細胞的培養基終止消化。
3. 輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1200RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，加入1mL培養液后吹勻。
4. 移入到事先準備好的含有5ml培養基的T-25培養瓶中或含有14ml培養基的T-75培養瓶中培養。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，先要消化處理并進行細胞計數。消化方法按照細胞傳代方法的1-3步驟進行，后的重懸液使用血清。懸浮細胞直接計數后離心，用血清重懸浮，加DMSO至終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X10⁶個細胞凍存。

注意事項：
1. 收到凍存管細胞后，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。
2. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
3. 細胞用途：僅供科研使用。

發貨方式：
復蘇后發貨：我們復蘇細胞后發貨，貨期一周左右，免運費。（氣溫較好建議復蘇后發貨）
凍存發貨(干冰運輸）：需額外增加干冰運費，選擇干冰運輸的我們發兩管細胞，為了保證客戶接種可靠性多發一管。（氣溫低于0℃須凍存發貨）
細胞發貨采取專業的運輸包裝，并選擇快捷的運輸方式（順豐速運或其他空運快遞）
本公司細胞引種來源：ATCC、DSMZ、ECACC、武大細胞庫、上海生化細胞所、中國科學院典型培養物保藏委員會等。

細胞培養常用試劑使用問答
1.谷氨酰胺使用方法是什么？
答：谷氨酰胺在溶液中很不穩定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養液中。
2.碳酸氫鈉在室溫條件存放是否穩定？
答：碳酸氫鈉白色粉末，或不透明單斜晶系細微結晶。比重2.159。無臭、味咸，可溶于水，微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微堿性，受熱易分解，在65℃以上迅速分解，在270℃時*失去二氧化碳，在干燥空氣中無變化，在潮濕空氣中緩慢分解。
3.培養細胞生長減慢的原因有哪些？其解決辦法有哪些？
 答：可能得原因有：更換了不同的培養液或血清；培養液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子等耗盡或缺乏或已被破壞；培養物中有少量細菌或真菌污染；試劑保存不當；比較新培養液與原培養液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗找出可能的原因。
解決辦法：增加起始培養細胞濃度；讓細胞逐漸適應新培養液；換入新鮮配制培養液；補加谷氨酰胺或生長因子等；用無抗生素培養液培養，如發現污染，丟棄培養物，或用抗生素除菌；血清需保存在-5℃到-20℃；培養液需在2－8℃避光保存；含血清*培養液在2-8℃保存，并在2 周內用完；分離培養物，檢測支原體。
4.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？
答：L-谷氨酰胺在細胞培養時非常重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，降解率隨保存溫度而變。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。
5.細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎？
答：不見得！因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力*。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復沖洗細胞培養瓶，以便于將含血清的培養基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：
     (1)0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA；
     (2)0.25% 胰蛋白酶
     多數細胞傳代消化可使用0.25％胰蛋白酶＋0.02％EDTA這種消化液。
6.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？
答：二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。